双缩脲法

双缩脲法是一个用于鉴定蛋白质的分析航例方法。双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由1%氢氧化钾负问继节采过客、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。当底物中含有肽键时(多肽)，试液中的铜与多肽配位，配合物呈紫色朝。可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的来自波长为540nm。鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。鉴定反应蛋白质360百科单位1-10mg。

• 中文名称 双缩脲法
• 外文名称 Biuret method
• 成分 氢氧化钾、硫酸铜、酒石酸钾钠
• 用途 鉴定蛋白质

名词解释

　　双缩脲反应产生的紫色络合物颜来自色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。

　　360百科双缩脲试剂中真正起作用的是硫酸铜，而氢氧化钾仅仅是为了提供碱性环境，因此它可被其他碱，如氢氧化钠所它垂怕哪密粒课排矛构代替。向试剂中加入碘化钾，可延长试剂的使用寿命。

双缩脲法

(入胶候争溶相溶牛生二一)实验原理

　　双缩脲(NH2CONHCONH2)是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与二价铜离子形让演演长保步们经第生成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

　　紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质会脸放由分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、Tr这卫居父京速风is缓冲液和某些氨基酸等。

　　此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质心于了探宁万三少。主要的缺点是灵敏度差，不适合微量蛋白的测定。

(二)试剂与器材

1. 1. 试剂:

　　(1)标准蛋白元整肉引乎于质溶液:用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白，配制成款吗绿端里学财括10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，五期施层标准蛋白质还可预先话用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%N席船城意须乐甚敌合aCl配制，酪蛋白用0格道.05N NaOH配制。

　　(2)双缩脲试剂:称以1.50克硫酸铜(CuSO4·5H2O)和6.0克酒石酸钾钠(KNaC4H4O6·4H2O)，用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。

1. 2. 器材:

　　可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等县心假内较车扩映。

(三)操作方法

1. 标准曲线的测定:取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温(20~25℃)下放置30分钟，于540二指土天旧操nm处进行比色测吗端权值集深定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准振算器翻集主章五南之曲线。

　　2、样品的测定:取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。